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      RhoA Activation Assay Kit

      價格6800.00
      品牌NewEastbio   
      產地美國
      貨號80601
      免疫原小鼠
      規格20Test
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      • 概述

        Configuration-specific Monoclonal Antibody Based

        RhoA Activation Assay Kit

        Catalog Number:80601

        20 assays



        產品說明

            小 G 蛋白是從屬于細胞調節因子中的一個超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一個亞家族,它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發揮主要作用。而本試劑盒中的 RhoA 就屬于Rho 亞家族中的一種, RhoA 參與生理活動過程中其分子結構會呈現出 2 種相互轉換的形式:與 GTP 結合的激活狀態和與 GDP 結合的非活性狀態。

            目前RhoA蛋白活性的檢測主要是依據小GTP酶RhoA可以與RhoA效應蛋白(Rhotekin)的 RBD 區域結合,使 RhoA 效應蛋白活化從而發揮生物學功能,進而間接的進行 RhoA 活性功能的監測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度過快以及 RhoA-GTP 結合蛋白與 RBD 結合區域之間較低的親和力,導致這種檢測方法的重復性較差。

           而武漢紐斯特生物技術有限公司推出的 RhoA 活性檢測試劑盒主要是依據單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構象的 RhoA-GTP 結合蛋白,而不識別 RhoA-GDP 結合蛋白,進而簡單并且快速的進行 RhoA 的活性檢測。同時試劑盒中的 RhoA-GTP 單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中 RhoA 的活性監測。每套試劑盒可以進行 20 次檢測。檢測原理

            武漢紐斯特生物技術有限公司的 RhoA 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的 RhoA-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的(樣品需要進行 GTPγS 活化處理)活性 RhoA-GTP 的水平。簡言之,特異性識別 RhoA 活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的 RhoA-GTP 活性蛋白,然后利用 protein A/G 將抗原抗體的結合物吸附下來,再利用特異性識別 RhoA 活化構象的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。


        試劑盒成分

        1. 特異性識別 RhoA 活性構象的鼠單克隆抗體(Anti-active RhoA, Mouse Monoclonal  Antibody (Catalog No. 26904)):小管裝--30ul (抗體濃度是 1mg/ml),抗體溶于 PBS(pH7.4)并包含 50%的甘油和 0.05%的疊氮化鈉。此抗體可以特異性識別所有脊椎動物中的  RhoA-GTP。

        2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) :小管裝—400ul 包含 200ul Protein A/G agarose和 200ul 20%乙醇溶液。(使用時溶液需要充分混勻,再吸?。?/p>

        3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303):小瓶裝—30mL 包含 250 mMTris-HCl (pH8.0),750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

        4. 特異性識別 RhoA 活性構象的兔多克隆抗體(Anti-RhoA, Rabbit Polyclonal Antibody

            (Catalog No.21009)):小管裝--30ul (抗體濃度是 1mg/ml),抗體溶于 PBS(pH 7.4包含有 50%的甘油。

        5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) :小管裝—100ul (10 mM) ,實驗中 0.5mL 細胞裂解液使用 5ul GTPγS 標記。

        6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) :小管裝—100ul (100 mM) ,實驗中 0.5mL 細胞裂解液使用 5ul GDP 標記。


        儲存條件

        試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內必須存放于 4°C 條件下保存。


        試劑(試劑盒內不提供,由實驗者自行配置)

        1. 刺激和未刺激的細胞裂解物;

        2. 蛋白酶抑制劑;

        3. 4 °C 搖桿或者搖床;

        4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);

        5. 1 M MgCl2;

        6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;

        7. 電泳和免疫印跡相關試劑;

        8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

        Tween-20);

        9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA);

        10. PVDF 或硝酸纖維素膜; 

        11. 二抗;

        12. ECL 檢測試劑;


        試劑制備

        1X Assay/Lysis Buffer:實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液,

        并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 μg/mL

        aprotinin(抑肽酶)。


        樣品處理

        貼壁細胞

        1. 培養細胞密度達到大約 80%-90%之間(直徑 10 cm 培養皿,~10

        7個細胞),并用活性劑或抑制劑進行處理。

        2. 吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

        3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL)。

        4. 將培養皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

        5. 用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

        6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

        7. 如果核發生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時,

            將細胞裂解物用 27?的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因組 DNA,從而避免上述

            情況的出現。

        8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

        9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的

            樣品存放于-70°C 條件下。

        懸浮細胞

        1. 培養細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

        2. 計數細胞后離心。

        3. 吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

        4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液(每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL)。

        5. 反復吹打細胞進行裂解。

        6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

        7. 如果核發生裂解,細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時,

            將細胞裂解物用 27?的注射器針頭來回吸取 3-4 次,以破壞基因組 DNA,從而避免上述

            情況的出現。

        8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

        9. 收集上清(~1-2 mg 總蛋白)并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用,請將處理后的

            樣品存放于-70°C 條件下。


        體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照

        注意:在細胞體內環境條件下大約有 10%的 RhoA 被激活,而在體外用 GTPγS 處理大約有

        90%的 RhoA 被激活。

        1. 準備兩個離心管,每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物(如果是純的 RhoA 蛋白則每

        個管中加入的蛋白量為 1ug)。

        2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

        3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS(終濃度即為 100 uM)作為陽性對照。另一個管中加

        入 5ul 的 100X GDP(終濃度即為 1 mM)作為陰性對照。

        4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

        5. 終止反應:將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。


        檢測步驟

        Ι. 活性 RhoA Pull-Down 實驗

        1. 等分 0.5-1 mL 的細胞裂解物至微量離心管中。

        2. 向管中加入 1mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液。

        3. 向管中加入 1ul 的活性 RhoA 單克隆抗體。

        4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻,然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心

        管中。

        5. 將管置于 4°C 條件下孵育 1H,并輕輕的進行搖動。

        6. 5000g,離心 1 分鐘。

        7. 棄上清,這一步要非常小心以避免珠子的損失。

        8. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次,離心并棄去上清。

        9. 最后一次洗滌后,小心的移去所有的上清。

        10. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

        11. 樣品煮沸 5min。

        12. 5000g,離心 10s。


        II. 電泳和轉膜

        1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

        2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

        3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。

        III. 免疫印跡反應和檢測(所有步驟都是在室溫下進行,并不斷攪拌)

        1. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s,然后在室溫放置 5 min 晾干。

        注意:如果使用的是硝化纖維素膜,此步省略。

        2. 封閉:用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1H 進行封閉,并

        需要恒定振蕩。

        3. 孵育一抗:用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋特異性識別 RhoA 活性構

        象的兔多克隆抗體(稀釋比例為 1:50-1:1000,主要根據樣品中含有的 RhoA 蛋白的量),

        室溫下孵育 1-2 小時,或者 4°C 條件下過夜孵育。

        4. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

        5. 孵育二抗:(例如羊抗兔 IgG-HRP),用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按

        1:1000 稀釋比例稀釋后使用,室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

        6. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

        7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。


        示例結果

        下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的 RhoA 活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅

        供參考。 

        QQ截圖20191115102102.png


        Rho 活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)用血小板衍生因子(PDGF)處理(Lane 2)

        和未處理(Lane 1)。細胞裂解物用特異性識別 RhoA 活性構象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26904)

        孵育(上圖)?;钚?RhoA 珠子顆粒用特異性識別 RhoA 活性構象的兔多克隆抗體(Cat # 21009)

        進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性 RhoA 的 Western blot 實驗結果。 


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        21009Anti-RhoA Rabbit Polyclonal Antibody 100 μL ¥2600


        參考文獻
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